Od 1988 roku pracował w rosyjskim KGB, a później w jego następczyni FSB. Zajmował się przestępczością zorganizowaną i terroryzmem.

W 1998 roku otrzymał od swoich przełożonych rozkaz zabicia rosyjskiego oligarchy żydowskiego pochodzenia Borysa Bieriezowskiego. Nie wykonał jednak zlecenia, ale ujawnił je Bieriezowskiemu, a później opinii publicznej. Został wydalony ze służby, a potem kilkakrotnie aresztowany pod fałszywymi zarzutami.

W 2001 roku przez Gruzję i Turcję uciekł z Rosji do Wielkiej Brytanii, gdzie uzyskał azyl polityczny. Przygotowywał książkę "Wysadzić Rosję", która ujawnia kulisy działań Federalnej Służby Bezpieczeństwa w Rosji (m. in. przeprowadzenie przez nią zamachów terrorystycznych w Moskwie w 1994 roku i zrzucenie winy na Czeczenów, by uzyskać pretekst do wywołania I wojny czeczeńskiej).

W listopadzie 2006 roku (przeprowadzał wówczas dochodzenie w sprawie zabójstwa Anny Politowskiej, niezależnej rosyjskiej dziennikarki) został otruty silnie toksycznym izotopem polonu 210 - według brytyjskich śledczych - przez Andrieja Ługowoja, byłego agenta FSB. Sam Ługowoj twierdzi, że otrucie Litwinienki to zemsta brytyjskiego wywiadu, który bezskutecznie próbował go zwerbować i nakłonić do zbierania materiałów kompromitujących prezydenta Putina i jego rodzinę.

Aleksander Litwinienko zmarł w szpitalu w nocy 23 listopada, W pożegnalnym liście odpowiedzialnością za swoje otrucie obarczył prezydenta Rosji, Władimira Putina.